成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件

 　　成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：
　　凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析。
　　吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析。
　　处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上。
　　处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测。
　　成功进行Western Blot检测，则设置合适正确的对照是*的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
　　阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率
　　阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性
　　二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性
　　内参对照：检测标本的质量和二抗系统
　　空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
　　Western Blot检测基本过程
　　1、获取细胞或组织裂解物
　　1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：
　　)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！
　　2、蛋白定量
　　常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白
　　3、电泳分离蛋白质
　　根据待测蛋白状态确定电泳条件
　　根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度
　　4、转膜
　　根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率zui高。
　　5、封闭
　　去掉膜上多余的非特异性结合位点，降低背景。常用的封闭溶液有：含BSA或者脱脂奶粉的TBST或TBS
　　6、一抗孵育
　　一抗的选择成功与否，是整个WB实验成功的关键：选择一抗有以下几个注意点：
　　选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证）
　　选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证）
　　选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体
　　一抗的保存和使用：
　　根据说明书的要求条件进行抗体的保存；一般需要将抗体分装后放入-20度保存，避免反复冻融。
　　抗体的工作液现配现用，在4度保存不要超过2周
　　根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。由于实验室条件和检测方法等的差异，说明书推荐的稀释比例只作参考，需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测，然后选择信噪比的抗体浓度进行实验。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索*稀释度（1:100-1:3000）。
　　孵育条件：推荐4°C孵育过夜（一般大于18个小时），根据抗体亲和力不同孵育时间有所区别
　　内参的选择和使用：WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！
　　7、二抗孵育
　　根据说明书推荐浓度使用TBST稀释一抗。如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索*稀释度（1:1000-1:20000）。孵育条件一般为室温1-2小时
　　8、底物孵育
　　选择显色或者化学发光底物。一般倾向于化学发光，灵敏度高且背景低，节省抗体用量
　　9、结果分析和检测
　　凝胶成像系统检测或者暗室曝光到胶片
　　Note：从封闭开始，每步之间都需要用TBST进行洗涤，3次，每次5min